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紹興醫學膜片鉗電生理技術技術

來源: 發布時間:2023-02-01

膜片鉗技術的基本原理和方法:膜片鉗技術是在電壓鉗技術基礎上發展起來的,電壓鉗是利用負反饋技術將膜電位在空間和時間上固定于某一測定值,以研究動作電位產生過程中膜的離子通透性與膜電位之間的依從關系。但電壓鉗只能研究一個細胞上眾多通道的綜合活動規律,而無法反映單個通道的活動特點,同時通過細胞內微電極引導記錄的離子通道電流其背景噪聲太大。膜片鉗技術的優勢是可利用負反饋電子線路,將微電極吸附的1μm2至幾個平方微米細胞膜的電位固定在一定水平上,對通過通道的微小離子電流作動態或靜態的觀察。膜片鉗和電壓鉗的區別:電位固定的細胞膜面積不同,進而所研究的離子通道數目不同。紹興醫學膜片鉗電生理技術技術

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膜片鉗電生理技術的樣本種類:從較早的肌細胞、神經元和內分泌細胞發展到血細胞、肝細胞、耳蝸毛細胞、胃壁細胞、上皮細胞、內皮細胞、免疫細胞、精母細胞等多種細胞;從急性分散細胞和培養細胞發展到組織片乃至整體動物;從蝸牛、青蛙、蠑螈、爪蟾母細胞發展到雞細胞、大鼠細胞、人細胞等;從動物細胞發展到細菌及植物細胞。此外,膜片鉗技術還普遍地應用到平面雙分子層(planarbilayer)、脂質體(liposome)等人工標本上。研究對象:從對離子通道(配體門控性離子通道、電壓門控性離子通道、第二信使介導的離子通道、機械敏感性離子通道及縫隙連接通道等)的研究發展到對離子泵、交換體及可興奮細胞的胞吞、胞吐機制的研究等。膜片鉗電極已不單單是傳統意義上的電信號記錄電極,它還可作為其他研究方法的工具使用,如用于進行單細胞PCR技術時的細胞內容物抽吸。紹興細胞生物學電生理膜片鉗原理膜片鉗的應用:與藥物作用有關的心肌離子通道。

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膜片鉗使用的基本方法是,把經過加熱拋光的玻璃微電極在液壓推進器的操縱下,與清潔處理過的細胞膜形成高阻抗封接,導致電極內膜片與電極外的膜在電學上和化學上隔離起來,由于電性能隔離與微電極的相對低電阻(1~5MΩ),只要對微電極施以電壓就能對膜片進行鉗制,從微電極引出的微小離子電流通過高分辨、低噪聲、高保真的電流-電壓轉換放大器輸送至電子計算機進行分析處理。膜片鉗技術實現的關鍵是建立高阻抗封接,并能通過特定的記錄儀器反映這些變化,因而,膜片鉗實驗室除了一般電生理實驗所需的儀器外,還特需防震工作臺、屏蔽罩、膜片鉗放大器、三維液壓操縱器、倒置顯微鏡、數據采集卡、數據記錄和分析系統等。

膜片鉗技術—打開細胞電生理研究之門:膜片鉗技術(patchclamptechniques)是采用鉗制電壓或電流的方法對生物膜上離子通道的電活動進行記錄的微電極技術。膜片鉗技術的原理:用一個尖銳端直徑在1.5-3.0um的玻璃微電極接觸細胞膜表面,通過負壓吸引使電極尖銳端與細胞膜之間形成千兆歐姆以上的阻抗封接,此時電極尖銳端下的細胞膜小區域(膜片,patch)與其周圍在電學上分隔,在此基礎上固定(鉗制,Clamp)電位,對此膜片上的離子通道的離子電流進行監測及記錄。膜片鉗技術可用于研究特殊制備的巨型球狀體中的細菌離子通道。

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一種電生理膜片鉗灌流裝置的制造方法:為了測量在不同藥物對細胞中的離子通道的影響,通常都需要在膜片鉗實驗中實施灌流。例如,需要檢驗某種是否對某種離子通道的影響,則需要在細胞封接后記錄電流數據,然后通過在細胞周圍快速給藥再次記錄電流數據即可對比數據判斷該對離子通道的影響。以往多采用橡皮泥等簡單設備固定灌流管進行實驗,經常出現灌流管固定不良影響實驗的情況,也有精密的灌流裝置,但是結構復雜,且成本非常高。膜片鉗使用的注意事項:向玻璃微電極灌注內液時切勿灌太多,以防液體進入銀絲底部增加噪聲。紹興細胞生物學電生理膜片鉗原理

膜片鉗使用操作注意:封接范圍內細胞膜光有少數離子通道。紹興醫學膜片鉗電生理技術技術

膜片鉗系統有如下應用局限性(1)光能應用于懸浮細胞的紀錄,因此大部分的紀錄對象為化細胞,而對于需要貼壁生長的大多數正常細胞,現有的自動膜片鉗系統就無法紀錄;(2)在紀錄對象上,目前的膜片鉗系統只能紀錄胞膜形狀平整飽滿的細胞,大部分是工具細胞如化細胞,此類細胞有比較強的細胞膜可以禁得起各種人為操作,而許多具有研究價值的細胞(例如元代培養的神經元)胞膜較弱容易破裂,且胞體表面不規整,現有的自動膜片鉗系統難以派上用場。紹興醫學膜片鉗電生理技術技術

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